討論

啤酒中的早期氧化反應可以用方案1所示的機制來描述，該機制基于鐵催化的氧氣捕獲導致過氧化氫的初始形成，然后通過芬頓反應引發乙醇氧化。在本研究中，重點在于鐵作為促氧化催化劑；然而，痕量水平的銅預計發揮與鐵類似的作用。基于模型研究，已為葡萄酒中金屬催化氧化提出了類似的機制，因此它們可能對廣泛的酒精飲料具有普遍相關性。氧氣既在過氧化氫的初始形成中被消耗，也在乙醇氧化循環中被消耗，因此耗氧速率是氧化方案兩部分總和的度量。ESR滯后期測量基于捕獲1-羥乙基自由基，該自由基是乙醇氧化的核心中間體。

乙醇氧化涉及氫過氧自由基的形成，其歧化生成氧氣和過氧化氫（反應4）。因此，乙醇氧化的總化學計量等價于反應5，這強調了過氧化氫和 Fe(II) 與氧氣一起被消耗。

2 HOO? → H2O2 + O2    (4)

2 CH3CH2OH + O2 + H2O2 + 2 Fe2+ + 2 H+ → 2 CH3CHO + 4 H2O + 2 Fe3+    (5)

H2O2 + HSO3- → H2O + SO42- + H+    (6)

過氧化氫是方案1中將初始氧氣捕獲與乙醇氧化聯系起來的核心中間體。然而，過氧化氫也可能與亞硫酸鹽反應（反應6），該反應與芬頓反應（反應1）之間的競爭決定了被氧化的乙醇量。在葡萄酒中，已證實芬頓反應與 H2O2 和亞硫酸鹽的直接反應之間存在類似的競爭。本研究中使用的啤酒含有 140μM 亞硫酸鹽。在 8 h 大氣空氣條件下保存啤酒導致 92μM 氧氣的線性消耗（圖1）。在相同條件下，僅消耗了約 60μM 亞硫酸鹽（圖6），這表明乙醇氧化在一定程度上與亞硫酸鹽的反應同時發生，根據反應5導致額外的氧氣消耗。發現亞硫酸鹽的消耗主要取決于 H2O2 的添加，而不取決于鐵的添加（圖5），這支持了亞硫酸鹽與過氧化氫之間的直接反應。在本研究使用的啤酒中，也觀察到了這種競爭，因為當添加遞增的 H2O2 濃度時，觀察到更短的ESR滯后期，而在 Fe(II) 存在下，啤酒中形成的自由基初始水平也隨 H2O2 濃度增加而增加（圖4A）。

H2O2 參與芬頓反應（導致乙醇氧化）或與亞硫酸鹽反應的競爭取決于兩條反應路徑的動力學。H2O2 與亞硫酸鹽反應的速率常數約為 103 M-1 s-1，而芬頓反應的速率常數從60 M-1 s-1 到 105 M-1 s-1 不等，具體取決于 Fe(II) 的配體。因此，亞硫酸鹽濃度與 Fe(II) 濃度的比值決定了哪條反應路徑將占主導地位，當高鐵含量存在時，過氧化氫通過芬頓反應消耗，而在低鐵濃度下，與亞硫酸鹽的反應是主要途徑。因此，亞硫酸鹽的消耗及其作為抗氧化劑的效率將直接與存在的鐵離子和銅離子的相對量相關。

單獨添加鐵對耗氧速率和亞硫酸鹽消耗的影響很小，表明對氧氣初始捕獲的影響可忽略不計。然而，當過氧化氫也被添加時，鐵的添加產生了影響，根據方案1，這將直接引發乙醇氧化。有趣的是，添加 Fe(III) 或 Fe(II) 對啤酒強制老化過程中的耗氧、自由基形成、ESR測定的滯后期以及亞硫酸鹽濃度的降低具有相同的效果。Uchida和Ono已證明 Fe(II) 在啤酒中具有促氧化活性，可縮短ESR滯后期，但他們的研究中未包含 Fe(III)。最近，Kunz等人表明，具有烯二醇結構的美拉德反應中間產物能夠將啤酒中的 Fe(III) 還原為 Fe(II)。假設啤酒中 Fe(II) 和 Fe(III) 物種之間存在快速的氧化還原平衡，可以解釋添加這兩種物種的相似效果。多酚和亞硫酸鹽已被證明可有效將葡萄酒中的 Fe(III) 還原為 Fe(II)。然而，多酚在啤酒中扮演類似角色的可能性較小，因為它們既不抑制也不增加自由基的形成。在本研究中，我們觀察到添加 Fe(III) 不影響亞硫酸鹽濃度，這表明與葡萄酒不同，啤酒中的亞硫酸鹽不能還原 Fe(III)。這可能是由于pH值以及啤酒和葡萄酒中存在的配體類型不同所致。在葡萄酒中，鐵離子與酒石酸和蘋果酸配位。在啤酒中，鐵以帶負電、帶正電和中性物種的混合物形式存在，表明與多種配體配位。

啤酒中硫醇的濃度在不同孵育條件下下降（圖6B），但下降幅度不如亞硫酸鹽明顯。這表明硫醇在啤酒中作為抗氧化劑起次要作用。由于觀測到半胱氨酸的速率常數較低（10-2 到 10-3 M-1 s-1），預計硫醇不會與 H2O2 有效反應。因此，添加 180μM H2O2 對硫醇濃度的影響小于對亞硫酸鹽濃度的影響（圖6）。據推測，一旦啤酒中亞硫酸鹽耗盡，硫醇通過去除1-羥乙基自由基（方案1）作為次級抗氧化劑發揮作用。該反應的高速率常數 109 M-1 s-1 支持了這一點。然而，硫醇將與同樣以類似高速率常數與1-羥乙基自由基反應的酒花衍生的苦味酸競爭。最近，有人提出啤酒中的亞硫酸鹽和硫醇可能與老化醛類可逆結合形成加合物，并且這些醛類可能在啤酒老化過程中釋放。基于本研究的結果，與亞硫酸鹽結合的醛類將首先被釋放，隨后硫醇加合物在啤酒氧化的后期階段釋放。此外，大部分硫醇似乎能抵抗氧化，表明啤酒硫醇具有廣泛不同的氧化還原特性。有趣的是，觀察到硫醇的消耗不像亞硫酸鹽消耗那樣依賴溫度。這一觀察結果與之前在22和 35°C 下進行的啤酒儲存實驗一致，在該實驗中，亞硫酸鹽在 35°C 下耗盡更快，而硫醇的消耗對溫度的依賴性較小。這可能表明，暴露于熱（例如在長途運輸期間）的啤酒將耗盡其亞硫酸鹽（主要抗氧化劑）含量，但仍可能含有硫醇作為次級抗氧化劑。

發現啤酒中耗氧的溫度依賴性異常低，Q10 為1.3，這很可能是由于初始捕獲氧氣的反應焓較低。與單獨添加鐵或 H2O2 相比，向啤酒中添加鐵和 H2O2 的組合導致氧化速率增加（通過耗氧量測定）和自由基形成增加（通過ESR光譜測定），這與啤酒中芬頓介導的氧化導致乙醇氧化和1-羥乙基自由基的形成一致。發現亞硫酸鹽與芬頓反應競爭 H2O2，亞硫酸鹽的主要抗氧化機制是通過與 H2O2 的直接反應，而蛋白質硫醇被建議通過去除1-羥乙基自由基在啤酒中作為抗氧化劑發揮次要作用。基于這些結果，將有可能開發定量的動力學模型，這些模型可能用于預測啤酒的保質期以及各種內源性和外源性因素組合的影響。